RAW264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞），是由加利福尼亞索爾克研究所的W. C. Raschke在雄性BAB/14小鼠腹腔注射A-MuLV（Abelson鼠科白血病病毒）誘發(fā)腫瘤的腹水中建立的，是最常見的炎癥細胞模型之一。RAW264.7細胞一般呈圓形，貼壁生長（見圖1、圖2），具有較強的吞噬能力。在吞噬抗原后，細胞會釋放出趨化因子，促使分化，細胞伸出偽足，攀爬能力增強。在細胞培養(yǎng)過程中，如果細胞吞噬抗原過多、培養(yǎng)方法不當，會使細胞出現(xiàn)不同程度的分化，呈現(xiàn)出梭形、長梭形的形態(tài)。

圖1：RAW264.7正常形態(tài)

（100×）

圖2：RAW264.7正常形態(tài)

（200×）

細胞培養(yǎng)操作

 

 

細胞密度達80%時可使用細胞刮刀對細胞進行傳代分瓶處理。（勿用胰酶，胰酶易刺激RAW264.7細胞分化）

【操作步驟】：

1）吸出舊培養(yǎng)液，保留 2-3ml 培養(yǎng)液，使用無菌細胞刮刀沿著同一方向輕柔刮拭細胞（不要來回刮拭，容易破壞細胞膜導致細胞死亡）

2）收集刮落的細胞，離心（1000rpm,5min），棄上清。

3）重懸后按1:2~1:4比例傳代（首次傳代建議1:2），接種至含新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。

收到細胞后可于傳代培養(yǎng)穩(wěn)定2-3代開始凍存，建議邊培養(yǎng)邊凍存留種。

【常規(guī)凍存步驟】：

1）用細胞刮刀收集細胞，1000 rpm離心5分鐘，棄上清。

2）用凍存液（DMEM高糖 + 10% FBS + 10% DMSO）重懸，密度達70%可凍存一管（或以1×10?~5×10? cells/mL的密度重懸）。

3）分裝至凍存管（1 mL/管），4℃平衡15-30分鐘 → 轉入程序凍存盒（-1℃/min降溫）→ -80℃過夜 → 液氮長期保存。

【無血清凍存液（可選）】：

使用無血清凍存液（CellCook cat：CM1004SF）可省去程序降溫步驟，直接轉入-80℃保存，但仍建議放置24小時后再轉移至液氮。

無血清凍存液使用方法與使用效果參考→【無血清凍存液PK常規(guī)凍存液】

1）37℃水浴快速融化凍存管（1分鐘內），剩余少量冰晶時停止搖晃。

2）將細胞懸液轉移至含4-6 mL完全培養(yǎng)基的離心管中，混勻。

3）1000 rpm離心5分鐘，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸。

4）接種至含6-8 mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO?培養(yǎng)過夜，次日觀察細胞狀態(tài)。

培養(yǎng)要點&注意事項

 

 

正常狀態(tài)下，RAW264.7呈圓形或少量梭形。這株細胞很容易分化，培養(yǎng)時注意觀察細胞形態(tài)，培養(yǎng)環(huán)境惡劣或吞噬過多抗原后會促使該細胞呈現(xiàn)梭形、長梭形，形態(tài)發(fā)生變化。在培養(yǎng)過程中是無法保證100%不分化（由于細胞相對敏感細胞群中出現(xiàn)個別長觸角分化的細胞為正常現(xiàn)象，不影響整體細胞活力生長可繼續(xù)觀察培養(yǎng)），可通過傳代操作將分化比例控制在一定范圍內，吹打細胞時輕柔一些，吹打過于用力也會刺激分化。當出現(xiàn)較多分化細胞時可根據(jù)細胞情況選擇將上層圓潤未分化細胞輕輕吹下收集換瓶培養(yǎng)，下層貼壁牢固的分化細胞可直接淘汰丟棄。若分化細胞比例＞30%，建議棄用并復蘇新批次。

避免刺激因素：血清質量差、胰酶消化、吹打過猛、傳代間隔過長均可能誘導分化。

貼壁性差：RAW264.7細胞有聚團生長特性，貼壁性相比一般貼壁細胞會差一些。細胞密度過高或pH偏低時易脫落，可收集漂浮細胞繼續(xù)培養(yǎng)。

聚團處理：該細胞本身有聚團生長特性，正常培養(yǎng)過程中細胞會成片成團生長，若細胞嚴重聚團可更換優(yōu)質血清批次、輕柔吹打分散，或提高傳代頻率（密度達70%即傳代）。

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