Stable cell lines establishment
穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建
慢病毒載體（Lentiviral vector, LVs）是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效將目的基因（或RNAi）導(dǎo)入動(dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。慢病毒載體基因組是正鏈RNA，其基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生RNAi干擾。
慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細(xì)胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細(xì)胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，有鮮明的特色。大量文獻(xiàn)研究表明，慢病毒載體介導(dǎo)的目的基因長(zhǎng)期表達(dá)的組織或細(xì)胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，又很少引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，能達(dá)到良好的基因治療效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。已成為國(guó)際上最通用的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)之一，廣泛用于各類實(shí)驗(yàn)室。
我司采用的慢病毒載體屬于“第三代”慢病毒載體，其基因組的3’LTR的增強(qiáng)子功能發(fā)生了缺失，從而形成了所謂的“自滅活”（Self-inactivation，SIN），即該病毒基因組整合到細(xì)胞基因組后，不會(huì)產(chǎn)生新的子代病毒，也降低了對(duì)周圍基因的意外激活，因此具有較好的安全性。
我司慢病毒載體系統(tǒng)由表達(dá)載體pLenti-gene、包裝輔助載體pGag/Pol和pRev、包膜載體pVSV-G四質(zhì)粒組成。可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟捎貌煌谋磉_(dá)載體pLenti-gene，如基因表達(dá)研究采用pLV-Gene、RNA 干擾采用pLV-U6等進(jìn)行研究。pGag/Pol載體中含有HIV 病毒的gag 基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol 基因，編碼病毒特異性的酶；pRev 載體編碼rev 基因，是調(diào)節(jié)gag 和pol 基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。pVSV-G載體中含有單純皰疹病毒來(lái)源的VSV-G 基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。
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