5tgm1培養(yǎng)小tips

IMDM(Gibco cat:12440,或同配方) 10%胎牛血清

• 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：IMDM(CellCook:CM2011或Gibco cat:C12440500BT,或同配方)

• 血清：南美胎牛血清(CellCook cat:CM1002L)

• 添加劑：\

• 配套完全培養(yǎng)基(CellCook cat:CC9099M)

• 傳代比例：維持細(xì)胞密度在1*10^5-2*10^6cells/ml

• 傳代方式：1:3傳代，離心收集(1000rpm,5分鐘)

• 換液頻率：2~3天換液1次

• 凍存液配方：RPMI 1640+10%FBS+10%DMSO

• 難度等級：+

• 培養(yǎng)要點(diǎn)：嚴(yán)格控制細(xì)胞密度，密度較高時(shí)容易產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片

• 1、這株細(xì)胞好養(yǎng)嗎？長得快嗎？

答：這株細(xì)胞培養(yǎng)難度系數(shù)不高，比較好養(yǎng)，狀態(tài)密度正常情況下長得還是比較快的，狀態(tài)較好1-2天也能達(dá)到傳代密度。

• 2、細(xì)胞狀態(tài)差是怎么樣的？怎樣算狀態(tài)差？

答：細(xì)胞變黑，折光度變差，有裂解傾向，死細(xì)胞變多，碎片雜質(zhì)變多，培養(yǎng)液變渾濁，細(xì)胞不聚團(tuán)。例如下圖細(xì)胞真菌污染后的狀態(tài)：

 

• 3、細(xì)胞密度很低不聚團(tuán)、生長慢怎么辦？

答:①豎瓶培養(yǎng)。豎瓶可以提高細(xì)胞密度促進(jìn)細(xì)胞生長，將培養(yǎng)瓶豎置時(shí)需注意吹下培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞，避免細(xì)胞殘留，密度起來后恢復(fù)水平放置，以保持一定氣液比保證細(xì)胞呼吸，避免長期豎瓶讓細(xì)胞出現(xiàn)傳質(zhì)問題；

②提高血清濃度到15%調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)；

③傳代密度不要太低，控制好傳代比例。

• 4、這株細(xì)胞什么時(shí)候可以傳代呢？該怎么傳代呢？

答：懸浮細(xì)胞是否能傳代主要通過細(xì)胞計(jì)數(shù)看細(xì)胞密度來判斷。懸浮細(xì)胞常規(guī)推薦接種密度為3-5×10⁵cell/mL，生長到2×10⁶cell/mL左右可繼續(xù)傳代。正常情況下可通過離心（800-1000rpm，5min）收集1:3傳代。（這株細(xì)胞需要注意控制細(xì)胞密度，有一定密度依賴，細(xì)胞狀態(tài)不好密度太低可能會不增殖，密度太高時(shí)容易產(chǎn)生大量碎片）.

• 5、細(xì)胞剛復(fù)蘇狀態(tài)不好怎么辦？

答：復(fù)蘇第二天如果細(xì)胞狀態(tài)不行可以補(bǔ)加血清、因子調(diào)整，如果細(xì)胞狀態(tài)實(shí)在太差死細(xì)胞及細(xì)胞碎片比較多，細(xì)胞生長環(huán)境太差可以考慮先離心去除細(xì)胞碎片，換新鮮培養(yǎng)基及提高血清濃度培養(yǎng)觀察細(xì)胞狀態(tài)（看情況，懸浮細(xì)胞復(fù)蘇三天內(nèi)一般不建議離心換液）。

很多懸浮細(xì)胞剛復(fù)蘇時(shí)活力是相對較差的，此時(shí)我們需要給點(diǎn)耐心，等待細(xì)胞完成自我修復(fù)進(jìn)入對數(shù)增長期。比如THP-1復(fù)蘇后往往需要7-10天的恢復(fù)期，Jurkat，Clone E6-1復(fù)蘇后也需要5-7天才能恢復(fù)狀態(tài)。很多新手在此期間容易失去信心就直接放棄培養(yǎng)了，還是需要多一點(diǎn)耐心哦！