思想準(zhǔn)備：

培養(yǎng)NK92細(xì)胞之前必須有充足的思想準(zhǔn)備，這株細(xì)胞非常不好養(yǎng)，而且不能偷懶，必須勤快。細(xì)胞對(duì)氧氣、密度和養(yǎng)分非常敏感，稍微偷懶拖一天不換液，可能就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞全部死亡的后果。只要保持換液和傳代頻率，多注意細(xì)胞密度，這株細(xì)胞還是可以征服的！
 

細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)：

細(xì)胞偏圓或偏橢圓，透亮，成團(tuán)生長(zhǎng)。只有成團(tuán)的細(xì)胞有增殖活性，單個(gè)的細(xì)胞基本沒(méi)有增殖活力（如下圖）。細(xì)胞團(tuán)可生長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的大團(tuán)塊。死了的細(xì)胞會(huì)皺縮，不再透亮而變得灰暗。細(xì)胞對(duì)氧氣、養(yǎng)分及細(xì)胞密度非常敏感。養(yǎng)分不夠或密度太高情況下，細(xì)胞很容易凋亡。

細(xì)胞培養(yǎng)技巧：

細(xì)胞剛復(fù)蘇或密度較低時(shí)可以把培養(yǎng)瓶立起來(lái)培養(yǎng)，以提高細(xì)胞密度，促進(jìn)細(xì)胞聚團(tuán)。當(dāng)細(xì)胞聚團(tuán)正常生長(zhǎng)后，建議平躺著培養(yǎng)該細(xì)胞，以增大空氣交換面積，且液體高度最好不要超過(guò)3mm，一般T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基，T75培養(yǎng)瓶加15ml左右培養(yǎng)基即可。培養(yǎng)基盡量現(xiàn)配，配好的培養(yǎng)基最好兩周內(nèi)用完，因?yàn)槿~酸和IL-2不穩(wěn)定易分解。

一般情況下細(xì)胞2-3天換液一次，即使培養(yǎng)基沒(méi)有變黃。換液時(shí)輕輕側(cè)過(guò)培養(yǎng)瓶/皿，不要使細(xì)胞飄起來(lái)，用巴氏吸管輕輕吸取部分上清棄去，補(bǔ)加等體積的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。或者將全部培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，吸去上清后用新鮮培養(yǎng)輕輕重懸后重新種瓶，重懸時(shí)不可吹打過(guò)度。細(xì)胞對(duì)離心和吹打比較敏感，離心和反復(fù)吹打會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)，建議只在細(xì)胞產(chǎn)生大量碎片時(shí)才離心清洗。平常換液建議半換，傳代可直接補(bǔ)加足夠新鮮的培養(yǎng)基后直接分瓶。

細(xì)胞團(tuán)長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)，且T25瓶子有幾十上百個(gè)小團(tuán)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)比較多，此時(shí)應(yīng)該2天換液一次。當(dāng)一個(gè)20倍視野有4-5個(gè)大細(xì)胞團(tuán)時(shí)應(yīng)該進(jìn)行傳代。傳代時(shí)加入兩倍體積的新鮮培養(yǎng)基后，輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)，將大的細(xì)胞團(tuán)打散成小團(tuán)，但不要?jiǎng)×掖荡虺蓡渭?xì)胞懸液，因?yàn)閱蝹€(gè)的細(xì)胞是基本沒(méi)有增殖活力的細(xì)胞，然后將混勻的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中。或者將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min后，棄去上清，加入三倍體積的新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸后轉(zhuǎn)移至三個(gè)新的培養(yǎng)瓶中。

NK-92凍存液用50%血清+40%完全培養(yǎng)基+10%DMSO, NK92/MI的凍存液則使用90%血清+10%DMSO。細(xì)胞數(shù)量應(yīng)在0.5-1.0×106/ml為宜。復(fù)蘇時(shí)可適當(dāng)加大胎牛血清的含量，以使細(xì)胞盡快長(zhǎng)起來(lái)。復(fù)蘇后細(xì)胞需要重新聚團(tuán)及較長(zhǎng)的潛伏期，故復(fù)蘇時(shí)間較長(zhǎng)，期間應(yīng)多加觀察，并注意更換培養(yǎng)基，頻率為3天一換（半換）。