Puromycin是來(lái)源于Streptomyces alboniger的一種氨基糖苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素，常用于篩選能夠表達(dá)pac基因的細(xì)胞。pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，如果表達(dá)該基因，就會(huì)對(duì)嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性目前普遍應(yīng)用于篩選表達(dá)pac基因的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定細(xì)胞株。目前，很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質(zhì)粒圖譜上標(biāo)記為 puror)，可以利用嘌呤霉素的篩選，得到特定基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。
Puromycin不僅能用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細(xì)胞株的維持。Puromycin的作用特點(diǎn)是快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的不表達(dá)pac基因的細(xì)胞。
嘌呤霉素是真核和原核生物中蛋白質(zhì)翻譯的有效抑制劑，其作用機(jī)制圖如下。嘌呤霉素通過(guò)模擬氨酰化tRNA(aa-tRNA) 的3'末端，代替正常氨基酸參與翻譯延長(zhǎng)過(guò)程。它通過(guò)核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心(PTC)催化摻入新生鏈的C末端，阻止進(jìn)一步延伸，導(dǎo)致翻譯過(guò)早的終止，從而抑制了蛋白質(zhì)合成，造成細(xì)胞死亡。
推薦的作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的嘌呤霉素濃度一般為1-10μg/mL，但最佳工作濃度需要通過(guò)劑量反應(yīng)曲線來(lái)確定。
將Puromycin按所需工作濃度添加到培養(yǎng)基中，用于待篩選細(xì)胞的培養(yǎng)；
逐步篩選：pac基因轉(zhuǎn)染48h后，用含有終濃度為2μg/mL的Puromycin的培養(yǎng)基換液；
傳代時(shí)，逐步增加Puromycin的濃度，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞株。推薦按照2/4/6/8/10的梯度逐漸增加Puromycin用量；
篩選過(guò)程中，建議不要使用細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，抗生素會(huì)影響部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
定期篩選：連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞篩選頻率為1-2個(gè)月，篩選時(shí)，將嘌呤霉素直接添加到培養(yǎng)基中，細(xì)胞正常培養(yǎng)傳代即可，每次篩選時(shí)間為一周，嘌呤霉素終濃度為4μg/mL；
長(zhǎng)期凍存的細(xì)胞，復(fù)蘇后第二代待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)，可進(jìn)行篩選，維持陽(yáng)性細(xì)胞比例。
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