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將外源基因?qū)爰?xì)胞，并使其在細(xì)胞中表達(dá)的方式可分為兩大類：

瞬時表達(dá)

瞬時表達(dá)（transient gene expression，TGE），即外源DNA/RNA不會整合到宿主染色體中，雖可達(dá)到高水平表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，一般會在96h內(nèi)失效；

穩(wěn)定表達(dá)

穩(wěn)定表達(dá)（Stable gene expression，SGE），即外源DNA會整合到宿主細(xì)胞染色體上，使宿主細(xì)胞可長期表達(dá)目的基因。

? 與瞬時轉(zhuǎn)染不同，穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建是指外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞并整合到細(xì)胞的染色體上，使宿主細(xì)胞可長期表達(dá)目的基因。穩(wěn)定細(xì)胞株有諸多用途，如蛋白抗體生產(chǎn)，信號傳導(dǎo)、藥物靶點研究，免疫治療藥物開發(fā)等，其表達(dá)的蛋白/抗體穩(wěn)定性更好和批次差異性更小。

穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株主要應(yīng)用于以下研究中

● 需要長期在目的細(xì)胞中研究基因功能。通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也方便長期的實驗研究；

● 部分蛋白半衰期長，瞬時RNA只能干擾表達(dá)，無法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白，通過構(gòu)建穩(wěn)定株可以實驗更好的基因干擾效果；

● 瞬轉(zhuǎn)會引入不可預(yù)期的拷貝數(shù)表達(dá)（往往瞬時表達(dá)較高），導(dǎo)致因為人為因素造成實驗結(jié)果的不精確，構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選到拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實驗研究；

● 穩(wěn)轉(zhuǎn)株可以用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的實驗，用于控制基因的時空表達(dá)；

● 需要用目的細(xì)胞構(gòu)建動物模型的實驗，往往需要構(gòu)建成穩(wěn)定株。

-實驗流程-

圖1 實驗流程

-慢病毒及慢病毒載體-

慢病毒（Lentivirus，LV）屬反轉(zhuǎn)錄病毒科（Retrovirus），是球形包膜病毒，直徑約80-120nm，含兩個拷貝的單鏈RNA基因組。基因組包含在由結(jié)構(gòu)和酶促蛋白核衣殼（NC）、衣殼（CA）、逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）組成的核心內(nèi)，核心被基質(zhì)（MA）蛋白的蛋白質(zhì)層包圍。包膜蛋白（ENV）嵌入病毒粒子脂質(zhì)包膜中，它與靶細(xì)胞受體結(jié)合并介導(dǎo)病毒粒子進(jìn)入。慢病毒幾乎可以感染所有種類的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長時間的穩(wěn)定表達(dá)，因此，慢病毒常用于制備穩(wěn)定表達(dá)/沉默特定基因的單克隆細(xì)胞株。

圖2 慢病毒結(jié)構(gòu)（Dufait et al., 2013）

慢病毒載體（Lentiviral vector, LVs）是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效將目的基因（或RNAi）導(dǎo)入動物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。慢病毒載體基因組是正鏈RNA，其基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生RNAi干擾。

慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細(xì)胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細(xì)胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，有鮮明的特色。

大量文獻(xiàn)研究表明，慢病毒載體介導(dǎo)的目的基因長期表達(dá)的組織或細(xì)胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，又很少引發(fā)機體免疫反應(yīng)，能達(dá)到良好的基因治療效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。已成為國際上最通用的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)之一，廣泛用于各類實驗室。

圖3 HIV-1基因組結(jié)構(gòu)與慢病毒載體包裝質(zhì)粒系統(tǒng)

（Dufait et al., 2013）

我司采用的慢病毒載體屬于“第三代”慢病毒載體，其基因組的3’LTR的增強子功能發(fā)生了缺失，從而形成了所謂的“自滅活”（Self-inactivation，SIN），即該病毒基因組整合到細(xì)胞基因組后，不會產(chǎn)生新的子代病毒，也降低了對周圍基因的意外激活，因此具有較好的安全性。

我司慢病毒載體系統(tǒng)由表達(dá)載體pLenti-gene、包裝輔助載體pGag/Pol和pRev、包膜載體pVSV-G四質(zhì)粒組成。可以根據(jù)實驗?zāi)康牟捎貌煌谋磉_(dá)載體pLenti-gene，如基因表達(dá)研究采用pLV-Gene、RNA干擾采用pLV-U6等進(jìn)行研究。pGag/Pol載體中含有HIV病毒的gag 基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；pRev載體編碼rev基因，是調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。pVSV-G載體中含有單純皰疹病毒來源的VSV-G 基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。

-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株-

構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的基本原理就是將外源DNA克隆到具有某種抗性（常見嘌呤霉素（Puromycin，Puro）、新霉素（Neomycin，Neo）或G418）的載體上，再將載體通過不同的轉(zhuǎn)染方式轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其整合到宿主染色體中，最后采用載體抗性進(jìn)行篩選，得到可穩(wěn)定過表達(dá)或沉默或敲除或編輯特定基因的細(xì)胞株。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)藥篩后，我司可提供多克隆細(xì)胞群或單克隆細(xì)胞株。