SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞作為神經(jīng)科學(xué)研究中常用的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，因具有易培養(yǎng)、可分化為神經(jīng)元樣表型等特性，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)退行性疾病及神經(jīng)毒性等研究領(lǐng)域。本文將系統(tǒng)梳理匯總這株細(xì)胞特征特性、培養(yǎng)要點(diǎn)難點(diǎn)等相關(guān)內(nèi)容。
SH-SY5Y細(xì)胞的特征與特性
（來(lái)源：https://www.atcc.org/products/crl-2266 ）
【來(lái)源與特性】：SH-SY5Y細(xì)胞來(lái)源于1970年建立的一神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的轉(zhuǎn)移骨瘤灶細(xì)胞SK-N-SH經(jīng)三次克隆后的亞系(SK-NSH→SH-SY→SH-SY5→SH-SY5Y)，具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，未分化狀態(tài)下呈圓形或多邊形，以貼壁懸浮混合形態(tài)生長(zhǎng)，增殖能力強(qiáng)。
【分化潛能】：在特定誘導(dǎo)條件（如視黃酸RA、佛波酯TPA等）下，可分化為具有神經(jīng)元樣特征的細(xì)胞，表現(xiàn)為長(zhǎng)出細(xì)長(zhǎng)突起、表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物（如β-III tubulin、MAP2），并具備一定的電生理活性。
【遺傳背景】：染色體核型不穩(wěn)定，存在異常核型（如超二倍體），研究中需注意其與原代神經(jīng)元的差異。
手把手教學(xué)
培養(yǎng)操作關(guān)鍵步驟
【培養(yǎng)體系】：DMEM/F12(CellCook cat:CM2012,或同配方)+10%胎牛血清(CellCook cat:CM1002L,或更高級(jí)別)；配套即用型完培（CellCook cat:CC2101S / CC2101M）
【傳代比例】：1:2傳代（培養(yǎng)面積比）
【換液頻率】：2-3天換液一次
【倍增時(shí)間】：50-60 hours（DSMZ）
【環(huán)境參數(shù)】：37℃、5% CO?飽和濕度培養(yǎng)箱，pH維持在7.2-7.4
? Step 1：當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)傳代，該細(xì)胞為貼壁懸浮混合細(xì)胞，懸浮細(xì)胞是活細(xì)胞，可先將懸浮部分吸出收集到離心管中；
? Step 2：用0.25%含EDTA胰酶置于 37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（鏡下觀察細(xì)胞變圓、間隙增大），待細(xì)胞變圓收縮成流沙狀態(tài)脫落后加入含血清培養(yǎng)基終止消化，將消化下來(lái)的細(xì)胞一起收集到上述離心管中；
? Step 3：1000rpm離心5分鐘，重懸后按1:2比例接種至新培養(yǎng)瓶。
【凍存】：
1、細(xì)胞匯合度80%以上，活力狀態(tài)較好時(shí)，可消化收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行凍存。
2、細(xì)胞沉淀用適量 4 °C 凍存液（DMEM/F12(含10%FBS)+10%DMSO）重懸， 一瓶 T25 細(xì)胞凍存一管（1ml/管），梯度降溫（4℃ 30分鐘→-20℃ 1小時(shí)→-80℃過(guò)夜→液氮長(zhǎng)期保存）或使用程序降溫盒降溫后再轉(zhuǎn)移至液氮中保存。凍存管需標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次、凍存日期。
若使用無(wú)血清凍存液可省去程序降溫步驟，直接轉(zhuǎn)入-80℃保存，但仍建議在-80℃放置24小時(shí)后再轉(zhuǎn)移至液氮。
無(wú)血清凍存液使用方法與使用效果參考下文鏈接→
《無(wú)血清凍存液PK常規(guī)凍存液》
【復(fù)蘇】：
1.液氮取出的細(xì)胞放入干冰或液氮中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞房，提前準(zhǔn)備好相關(guān)試劑耗材。
2.取出凍存管置于室溫?fù)]發(fā)液氮30s（如放入干冰轉(zhuǎn)移則不需要揮發(fā)液氮），再轉(zhuǎn)移到 37 °C 水浴中迅速解凍（1分鐘內(nèi)）。為了減少污染的可能性，保持凍存管瓶蓋在水浴液面之上。 一旦大部分內(nèi)容物解凍，立即將凍管移出水浴，70%的乙醇消毒凍存管外壁。
3.將含細(xì)胞的凍存液轉(zhuǎn)移到含 4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混勻，1000rpm離心5min去除DMSO ，重懸后接種（建議每個(gè) T25 培養(yǎng)瓶添加 6-8ml 完全培養(yǎng)基）轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)，24小時(shí)后更換培養(yǎng)基（去除死亡細(xì)胞）。復(fù)蘇后24小時(shí)內(nèi)避免移動(dòng)培養(yǎng)瓶，以促進(jìn)貼壁。
避坑指南
培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)要點(diǎn)
1. 該細(xì)胞增殖較緩慢，喜歡聚團(tuán)生長(zhǎng)，培養(yǎng)中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞倍增時(shí)間為48-72小時(shí)（按1:2傳3-4天可傳一次）；細(xì)胞傳代時(shí)比例不宜太高，培養(yǎng)密度不宜太低，一般1:2或1:3傳代較為合適，培養(yǎng)密度越低增殖速度越慢，細(xì)胞團(tuán)在傳代時(shí)需要吹散；細(xì)胞密度越高，培養(yǎng)基消耗越快，代謝廢物積累會(huì)導(dǎo)致pH下降（培養(yǎng)基變黃），需注意及時(shí)換液（2-3天/次）或傳代。
2. 剛接種時(shí)呈懸浮圓形，24小時(shí)內(nèi)貼壁，48小時(shí)后伸展為多邊形或短梭形； 匯合度過(guò)高（>90%）時(shí)，細(xì)胞會(huì)堆疊生長(zhǎng)，邊緣細(xì)胞形態(tài)拉長(zhǎng)，易脫離基質(zhì)；低血清環(huán)境（<5% FBS）下，細(xì)胞增殖減緩，部分會(huì)自發(fā)長(zhǎng)出短突起，類(lèi)似早期分化狀態(tài)。
3. SH-SY5Y屬于半貼壁細(xì)胞，貼壁能力中等，傳代后若貼壁率低（<50%），可能提示細(xì)胞活力下降或培養(yǎng)表面不適合。
4. 對(duì)環(huán)境敏感，溫度波動(dòng)超過(guò)±1℃可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞皺縮或脫落。CO?濃度不足會(huì)使培養(yǎng)基pH升高（變紫），細(xì)胞生長(zhǎng)停滯；濃度過(guò)高（>6%）則pH降低（變黃），易引發(fā)細(xì)胞凋亡。
5. 細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多易出現(xiàn)表型漂移，表現(xiàn)為分化能力下降（突起變短、標(biāo)志物表達(dá)減少）、增殖速率異常，建議邊擴(kuò)培邊凍存保種，實(shí)驗(yàn)盡量使用低代數(shù)細(xì)胞（前10代）。
常見(jiàn)問(wèn)題解決方案
細(xì)胞狀態(tài)差（顆粒增多、空泡化）
表現(xiàn)：細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量黑色顆粒或大小不等的空泡，邊緣模糊，增殖減緩。
常見(jiàn)原因：血清質(zhì)量差（含毒素或低活性）、凍存/復(fù)蘇過(guò)程損傷（DMSO濃度過(guò)高或復(fù)蘇溫度不當(dāng)）、消化過(guò)度或吹打過(guò)于劇烈、支原體污染（隱性感染，需通過(guò)PCR檢測(cè)確認(rèn)）。
解決方案：更換優(yōu)質(zhì)血清，優(yōu)先選擇經(jīng)細(xì)胞活力驗(yàn)證的批次；復(fù)蘇時(shí)37℃水浴快速解凍（1分鐘內(nèi)），離心去除DMSO，用預(yù)熱培養(yǎng)基重懸；適當(dāng)縮短控制消化時(shí)間，吹打操作輕柔一些；若確定支原體污染，可用支原體清除試劑（CellCook cat:ME01C）處理，或丟棄污染細(xì)胞（推薦，避免殘留影響）。
細(xì)胞抱團(tuán)生長(zhǎng)
表現(xiàn)：聚團(tuán)嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞聚集形成大小不一的團(tuán)塊，貼壁細(xì)胞減少，懸浮細(xì)胞增多。
常見(jiàn)原因：胰酶消化不充分（細(xì)胞間連接未斷開(kāi)）、傳代時(shí)細(xì)胞團(tuán)未吹散分開(kāi)、 培養(yǎng)基中鈣離子濃度異常（影響細(xì)胞間黏附）。
解決方案：若細(xì)胞抱團(tuán)嚴(yán)重，可以使用0.125%的胰蛋白酶，能緩解細(xì)胞消化后聚團(tuán)的情況，消化時(shí)確保胰酶覆蓋所有細(xì)胞，鏡下觀察至細(xì)胞邊緣收縮、間隙明顯后終止，可視情況適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間；傳代時(shí)用移液管輕柔吹打10-15次（避免產(chǎn)生氣泡），使細(xì)胞團(tuán)分散為單個(gè)細(xì)胞，傳代后成團(tuán)難展開(kāi)可先靜養(yǎng)幾天穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)再重新消化鋪板并將血清提高到15%。
細(xì)胞生長(zhǎng)異常緩慢
表現(xiàn)：細(xì)胞生長(zhǎng)超過(guò)正常傳代周期仍未達(dá)到可傳代匯合度，細(xì)胞趨于生長(zhǎng)停滯。
原因：血清品質(zhì)較差或培養(yǎng)基變質(zhì)、培養(yǎng)環(huán)境不穩(wěn)定、傳代接種密度太低、消化過(guò)度操作損傷、聚團(tuán)嚴(yán)重等。
解決：避免使用過(guò)期或反復(fù)凍融血清，使用新鮮配制完培；定期校準(zhǔn)培養(yǎng)箱，保證環(huán)境參數(shù)穩(wěn)定；根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)活力調(diào)整傳代比例，避免過(guò)度稀釋；注意操作要點(diǎn)。
培養(yǎng)基頻繁渾濁
表現(xiàn)：換液后1-2天培養(yǎng)基變渾濁（顆粒狀或白色絮狀或云霧狀），伴隨細(xì)胞狀態(tài)變差甚至死亡。
常見(jiàn)原因：操作污染（細(xì)菌或真菌污染，真菌可見(jiàn)菌絲）；培養(yǎng)箱污染（水箱或托盤(pán)長(zhǎng)期未清潔，滋生微生物）；細(xì)胞自身凋亡過(guò)多（釋放細(xì)胞碎片導(dǎo)致渾濁）。
解決方案：立即丟棄污染細(xì)胞，徹底消毒培養(yǎng)瓶/板及操作臺(tái)面，更換新培養(yǎng)基和試劑；每周清潔培養(yǎng)箱（用75%酒精擦拭內(nèi)壁，水箱添加抑菌劑）；若因凋亡導(dǎo)致，檢測(cè)細(xì)胞代數(shù)及培養(yǎng)條件，必要時(shí)復(fù)蘇低代次細(xì)胞。
文獻(xiàn)速遞
研究方向與應(yīng)用
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SH-SY5Y配套即用型完培（CellCook cat:CC2101S / CC2101M）
DMEM/F12(CellCook cat:CM2012,或同配方)
胎牛血清(CellCook cat:CM1002L,或更高級(jí)別)
0.25%胰酶-EDTA溶液（CellCook cat:CM1006）
本文所述方法僅供參考，具體操作需結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件優(yōu)化。
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